Utilisation de la technologie Microfluidizer pour le broyage cellulaire.

Ce document propose également un récapitulatif des avantages du Microfluidizer pour cette utilisation et présente les atouts spécifiques qu’offre la technologie Microfluidics en comparaison avec les autres méthodes de broyage cellulaire.

En effet, toutes les technologies utilisées pour le broyage cellulaire ne se valent pas. Les résultats publiés dans différentes revues scientifiques montrent que la méthode de broyage choisie influence fortement les propriétés physiques et chimiques du résultat final, comme par exemple le taux de désintégration, la viscosité ou la libération de protéines. Pour tous ces paramètres majeurs, le Microfluidizer montre les meilleurs résultats.

Le Microfluidizer permet d’obtenir un broyage cellulaire >95% de cellules d’E.Coli après un seul passage.

Le but du broyage cellulaire.

Le broyage cellulaire (également appelé lyse cellulaire ou dégradation cellulaire) est utilisé pour l’extraction des éléments contenus dans une cellule biologique, une bactérie, une levure, une plante, un insecte ou un mammalien. Le plus généralement, les cellules biologiques provenant d’un prélèvement naturel, d’un bioréacteur ou de cryoconservation sont mises en suspension dans une solution tampon par agitation ou brassage magnétique.

Cette solution tampon est ensuite utilisée pour procéder au broyage cellulaire. Le broyage cellulaire désigne le fait de briser la membrane plasmique contenant les éléments à extraire. Une fois que la membrane plasmique est brisée et fractionnée, différentes manipulations (comme la filtration ou la centrifugation ) peuvent être effectuées pour séparer le contenu des cellules des débris de membrane plasmique. Ce processus est utilisé aussi bien dans le milieu de la recherche que dans l’industrie. Le contenu des cellules comme les protéines, les enzymes, l’ADN, l’ARN, les biopolymères peuvent avoir différents usages :

• La description ou l’étude des mécanismes biologiques des cellules.
• L’identification des protéines. La cristallographie par rayon X, par exemple, permet de déterminer la structure d’une protéine.
• Le contenu des cellules peut être nécessaire pour certaines utilisations thérapeutiques comme c’est le cas pour l’insuline.
• La production de certaines substances comme les biopolymères ou les biocarburants.

 

Qui a besoin des technologies de broyage cellulaire ?

• Les entreprises développant de nouveaux traitements ou médicaments, comme les vaccins par exemple.
• Les instituts de recherche et développement, les entreprises et les universités officiant, entre autres, dans les domaines de la microbiologie, la biologie moléculaire, la biologie structurale, la biochimie, la biophysique ou la biotechnologie.
• Les entreprises de recherche en biopolymère ou de production de biocarburants.
• L’industrie nutraceutique.
• Certaines entreprises cosmétiques cherchent au coeur des cellules l’ingrédient de leur prochain sérum anti-âge.

 

Les technologies les plus utilisées.

Pour les échantillons de laboratoire.

La presse de French.

Dans une cellule de pression, une valve contrôlée de façon manuelle libère un fluide pressurisé, ce qui entraîne le broyage cellulaire. Ce processus ne permet pas de scale up et n’est pas réitérable. De plus, il demande un certain effort physique de la part de l’opérateur pour ouvrir et fermer la valve. L’utilisation de la presse de French comporte de nombreux aléas. Des instructions strictes sont supposées prévenir les éventuels dangers liés aux mauvais usages de cette machine. La presse de French exige un nettoyage long et fastidieux après chaque production d’échantillon. La plupart des fabricants de presses de French ont cessé leur production mais ces machines sont toujours utilisées, souvent achetées d’occasion, par de petites entreprises.

L’homogénéisateur haute pression (HHP) : Les prix sont généralement équivalents ou légèrement inférieurs à celui du Microfluidizer. Les principales différences reposent sur le refroidissement, le nettoyage, l’usure (notamment des valves) et le scale up.

Il s’agit de voir plus loin que les valeurs de pression et le coût des HHP. Il est important de prendre également en compte l’utilisation au quotidien et la qualité des résultats, notamment en termes de rendement, de séparation et de viscosité.

De nombreux utilisateurs des machines « Homogénésateur haute pression » les abandonnent après deux ans au profit du Microfluidizer, plus fiable.

Même en excluant le résultat du Microfluidizer avec 20 000 psi (1380 bar), les résultats obtenus sont bien supérieurs à ceux du HHP. Avec 20 000 psi (1350 bar) le Microfluidizer montre un taux de 78% de catalase de plus que le meilleur résultat obtenu par HHP

L’utilisation des ultrasons.

La méthode par ultrason fait appel aux forces cavicationnelles. Souvent utilisé pour la production d’échantillons de très faibles volumes, cette technique consiste à exposer la suspension cellulaire aux ultrasons grâce à une sonde ultrasonique. La hausse de la température ambiante entraîne une baisse du rendement. L’impossibilité du scale up et les nuisances sonores sont d’autres inconvénients de cette méthode, les avantages étant principalement le bas coût des équipements et la possibilité d’appliquer cette techniques à de très faibles volumes (de l’ordre du µl).

 

Le gel-dégel.

Il s’agit de soumettre la suspension cellulaire à des variations de température afin de provoquer la rupture de la membrane plasmique. Cette méthode est peu réitérable et les résultats peuvent varier. Le gel-dégel n’est applicable qu’à de très petits volumes d’échantillon, de l’ordre du ml, mais comporte l’avantage d’être une méthode peu coûteuse.

Saccharomyces cerevisiae. Avant broyage cellulaire et après 1, 5 et 10 passages à 30 000 psi (2070 bar)

 

La lyse chimique.

Cette méthode consiste à ajouter des substances chimiques à la suspension cellulaire afin de fragiliser et rompre la membrane plasmique. Les substances utilisées peuvent être coûteuses ce qui réduit considérablement la possibilité de scale up. De plus, les produits contaminent la préparation, ce qui n’est pas souhaitable.

 

Le pilon et le mortier.

Cela consiste simplement à moudre la suspension cellulaire. C’est un travail manuel laborieux qui peut nécessiter plusieurs minutes d’efforts. De plus, cette méthode n’est pas réitérable et exclu le scale up. De ce fait, elle n’est utilisée que pour la production d’échantillons de laboratoires de faibles volumes.

 

Le broyage (par exemple en utilisant un Dynomills ou un équipement comparable. Cf Willi Bachhofen, www.wab.ch)

Avec cette méthode la contamination et la température sont difficilement contrôlables, bien qu’elle constitue une manière efficace de broyer de nombreux types de cellules.

 

Le pré-traitement par enzymes.

Il est fréquent d’effectuer un pré-traitement de la suspension cellulaire avec des enzymes qui fragilisent la membrane plasmique avant de procéder à un broyage mécanique des cellules. Il est possible de conserver cette technique tout en l’associant à l’utilisation du Microfluidizer afin de réduire le degré de pression ou le nombre de passages nécessaires.

 

Pourquoi choisir Microfluidics ?

Facile à utiliser et simple d’entretien.

Les clients utilisant la technologie Microfluidics pour le broyage cellulaire apprécient particulièrement le fait que le Microfluidizer soit vraiment facile à utiliser et à nettoyer. De nombreux utilisateurs sont satisfaits de son utilisation dans leur laboratoire. Ils apprécient notamment le peu de maintenance qu’exige le Microfluidizer contrairement aux HHP, par exemple, dont les valves doivent être nettoyées manuellement et ne sont pas toujours faciles à remonter.

 

Le rendement.

Un refroidissement efficace améliore le rendement de protéines et d’enzymes. Durant le processus de broyage cellulaire, le refroidissement est primordial car le contenu des cellules biologiques est extrêmement sensible à la chaleur. Dans la plupart des cas, il commence à se dénaturer dés que la température dépasse 4°C. Si le Microfluidizer peut évidemment aller au delà de 4°C il ne pose pas de problème lié à la chaleur. En effet, si le système de refroidissement est correctement utilisé, avec de l’eau glacée par exemple, le temps d’exposition à des températures élevées dans le Microfluidizer s’avère très court.

Agerkvist et Enfors ont constaté des températures bien plus élevées après le passage dans un HHP qu’avec le Microfluidizer. De ce fait, le Microfluidizer montre un meilleur rendement d’enzymes ß galactosidase.

Il n’est pas toujours nécessaire d’éviter absolument les températures de 40 ou 50°C car la dénaturation des protéines par la chaleur dépend aussi bien du temps d’exposition que de la température. Le temps de passage dans le Microfluidizer varie entre 25ms et 40ms, soit une durée bien inférieure à celle d’un HHP. Un HHP expose l’échantillon à des températures plus élevées, et ce, pendant plus longtemps, par conséquent cela augmente la dénaturation comme constaté dans les chiffres de rendement.

 

La rapidité.

La première réaction après une démonstration du Microfluidizer est très souvent « C’était rapide ! ». En effet, la production d’échantillons nécessite beaucoup moins de temps qu’avec les autres méthodes. Dobrovestsky déclare procéder à seulement 2 passages à 15 000 psi (1035 bar) dans un M110EH contre trois passages à 17 000 psi (1172 bar) dans un Avestin Emulsiflex-C3.

 

Une viscosité plus faible.

La viscosité de la suspension de cellules broyées est très importante. Si la viscosité est trop élevée elle peut rendre tout traitement en aval , comme la filtration ou un pipetage précis, plus difficile. La viscosité des cellules désintégrées est très élevée après un passage dans le HHP mais diminue rapidement avec d’autres passages. Le broyage cellulaire avec le Microfluidizer présente une viscosité moindre après un seul passage, et une diminution de cette viscosité après plusieurs passages successifs.

 

Une meilleure filtration.

Le broyage cellulaire avec le Microfluidizer permet d’obtenir une meilleure séparations cellules désintégrées en comparaison avec le HHP. Le Microfluidizer broie efficacement mais délicatement les cellules, afin d’obtenir de plus grands fragments de membrane plasmique. Les particules de membrane obtenues grâce au Microfluidizer mesurent 450 nm contre 190 nm pour le HHP. Ces fragments plus grands sont plus faciles à séparer du contenu des cellules, ce qui induit un temps de filtration plus court et une meilleure séparation par centrifugation par rapport aux produits obtenus par d’autres méthodes de broyage, notamment le HHP.

 

Les cellules gram négatives comme E.Coli sont les plus communément utilisées lors des démonstrations et peuvent être broyées facilement. Les cellules gram positives sont plus résistantes et doivent subir un traitement semblable à celui des levures ou des algues.